Produkter

Det sätt på vilket effekterna av samtidiga mutationer kombineras för att ändra enzymaktivitet är inte lätt förutsägbart eftersom dessa effekter inte alltid är additiva på ett linjärt sätt.Därför kan karakteriseringen av effekterna av samtidiga mutationer av aminosyrarester som binder substratet ge ett betydande bidrag till förståelsen av substratspecificiteten hos enzymer.I beta-glykosidas från Spodoptera frugiperda (Sfbetagly) interagerar båda resterna Q39 och E451 med substratet och detta är väsentligt för att definiera substratspecificitet.Dubbelmutanter av Sfbetagly (A451E39, S451E39 och S451N39) framställdes genom platsriktad mutagenes, uttrycks i bakterier och renades med affinitetskromatografi.Dessa enzymer karakteriserades med användning av p-nitrofenyl beta-galaktosid och p-nitrofenyl beta-fukosid som substrat.K cat/Km-förhållandet för enkla och dubbla mutanter av Sfbetagly innehållande platsriktade mutationer vid positionerna Q39 och E451 användes för att visa att effekten på den fria energin av ESdouble dolk (enzym-övergångstillståndskomplex) av de dubbla mutationerna (Gdouble) daggerxy) är inte summan av effekterna från de enskilda mutationerna (Gdouble daggerx och Gdouble daggery).Denna skillnad i Gdouble dolk indikerar att effekterna av de enskilda mutationerna delvis överlappar varandra.Därför räknas denna vanliga effekt bara en gång i Gdouble daggerxy.Kristallografiska data på beta-glykosidaser avslöjar närvaron av en bidentat vätebindning som involverar resterna Q39 och E451 och samma hydroxylgrupp i substratet.Därför tyder både termodynamiska och kristallografiska data på att resterna Q39 och E451 utövar ett ömsesidigt inflytande på deras respektive interaktioner med substratet.