Produkter

Ny högpresterande vätskekromatografianalys för glykosyltransferaser baserad på derivatisering med antranilsyra och fluorescensdetektion.

Analyser utvecklades med användning av den unika märkningskemin av 2-aminobensoesyra (2AA; antranilsyra, AA) för att mäta aktiviteterna för både β1-4 galaktosyltransferas (GalT-1) och α2-6 sialyltransferas (ST-6) med högpresterande vätska kromatografi (HPLC) med fluorescensdetektion (Anumula KR. 2006. Framsteg inom fluorescensderivatiseringsmetoder för högpresterande vätskekromatografisk analys av glykoproteinkolhydrater. Anal Biochem. 350:1-23).N-acetylglukosamin (GlcNAc) och N-acetyllaktosamin användes som acceptorer och uridindifosfat (UDP)-galaktos och cytidinmonofosfat (CMP)-N-acetylneuraminsyra (NANA) som donatorer för GalT-1 respektive ST-6.Enzymatiska produkter märktes in situ med AA och separerades från substraten på TSKgel Amide 80-kolonn med användning av normalfasbetingelser.Enzymenheter bestämdes från toppareorna genom jämförelse med de samtidigt derivatiserade standarderna Gal-β1-4GlcNAc och NANA-a2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Linjäritet (tid och enzymkoncentration), precision (intra- och interassay) och reproducerbarhet för analyserna fastställdes.Analyserna visade sig vara användbara för att övervaka enzymaktiviteterna under isolering och rening.Analyserna var mycket känsliga och utfördes lika med eller bättre än de traditionella radioaktiva sockerbaserade mätningarna.Analysformatet kan också användas för att mäta aktiviteten hos andra transferaser, förutsatt att kolhydratacceptorerna innehåller en reducerande ände för märkning.En analys för glykoproteinacceptorer utvecklades med användning av IgG.En kort HPLC-profileringsmetod utvecklades för separation av IgG-glykaner (biantennära G0, G1, G2, mono- och disialylerade), vilket underlättade bestämningen av GalT-1- och ST-6-aktiviteter på ett snabbt sätt.Dessutom bör denna profileringsmetod visa sig användbar för att övervaka förändringarna i IgG-glykaner i kliniska miljöer.