Produkter

För att specifikt kvantifiera flera metaboliter av 5-fluorouracil (5-FU) och två endogena monofosfatnukleotider, utvecklade vi en originalmetod baserad på en vätskekromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS).Denna analys möjliggjorde bestämning av: (i) den intracellulära produktionen av 5-fluoro-2'-deoxiuridin-5'-monofosfat (5-FdUMP) från 5-FU eller 5-fluoro-2'-deoxiuridin (5-FdUrd) , (ii) påverkan av 5-FdUMP-koncentrationen på det intracellulära 2'-deoxiuridin-5'-monofosfat (dUMP)/tymidin-5'-monofosfat (TMP) förhållandet, och (iii) utsöndringsgraden av 5-FdUMP och 5-FU från humana odlade celler av ABC-transportörer.Under våra experimentella förhållanden inkuberades celler med 5-FU eller 5-FUrd.Sedan fälldes cellulära proteiner ut med metanol.Detta förfarande gav hög extraktionsåtervinning.Dessutom, för att mäta 5-FU och 5-FdUMP utsöndring från celler, utförde vi kvantifiering av dessa molekyler i odlingsmedium.Medierna injicerades antingen direkt (5-FU) eller genomgick en fastfasextraktion med användning av Oasis Wax-extraktionspatron (5-FdUMP).Separation av analyter utfördes på en dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm id) kolonn med isokratiskt läge med användning av ammoniumformiatbuffert/metanol/vatten (5/5/90, v/v) som mobil fas.Körtiden översteg inte 6,2 min.Analyterna joniserades i en elektrospraygränsyta under negativ jonmod.Vi validerade metoden över ett intervall på 2,5–150 ng mL -1 enligt föreningarna.Variabiliteten inom och mellan analyser var lägre än 10 % under sju dagar.Alla föreningar var stabila i celler eller i odlingsmedium när prover förvarades vid -20 ° C i minst två veckor och efter tre frys-upptiningscykler.Ingen matriseffekt observerades i båda medierna.