Produkter

Analysen av proteomomfattande fosforyleringshändelser är fortfarande en stor analytisk utmaning på grund av den enorma komplexiteten hos proteinfosforyleringsnätverk.I detta arbete utvärderar vi komplementariteten av Lys-N, Lys-C och trypsin med avseende på deras förmåga att bidra till den globala analysen av fosfoproteomet.En förfinad version av starkt katjonbyte med lågt pH användes för att effektivt separera N-terminalt acetylerade, fosforylerade och icke-modifierade peptider.Totalt 5036 icke-redundanta fosfopeptider kunde identifieras med en falsk upptäcktsfrekvens på <1 % från 1 mg protein med en kombination av de tre enzymerna.Våra data visade att överlappningen mellan fosfopeptiddatauppsättningarna som genererades med olika proteaser var marginell, medan överlappningen mellan två liknande genererade tryptiska datauppsättningar visade sig vara minst 4 gånger högre.På detta sätt möjliggjorde den parallella användningen av Lys-N och trypsin en 72% ökning av antalet detekterade fosfopeptider jämfört med trypsin enbart, medan ett trypsinreplikatexperiment endast ledde till en 25% ökning.Sålunda, när vi enbart fokuserade på trypsin- och Lys-N-data, identifierade vi 4671 icke-redundanta fosfopeptider.Ytterligare analys av de detekterade platserna visade att Lys-N- och trypsin-datauppsättningarna berikades med signifikant olika fosforyleringsmotiv, vilket ytterligare bevisar att multiproteasmetoder är mycket värdefulla i fosfoproteomanalyser.